Romano de nacimiento, Marco Di Vaio comenzó su carrera futbolística con la Lazio en 1993, cuando tan sólo tenía 17 años. Allí estuvo tres temporadas compaginando apariciones con el filial, pero apenas tuvo oportunidades y únicamente disputó 8 partidos en la Serie A, marcando 3 goles. Posteriormente pasó por el Verona y el Bari, con lo que jugó un total de 34 partidos en la Serie B. Su gran oportunidad llegó en 1997, con la Salernitana, donde se convirtió en el máximo goleador de esa temporada y ayudó a su equipo ascender a la Serie A. En dos años con ese club anotó 33 goles en 67 partidos jugados. En 1999 firmó con el Parma, donde se consagró definitivamente como «capocannoniere» del fútbol italiano.

Con el conjunto parmesano jugó tres temporadas, logrando el impresionante registro de 41 goles en 83 partidos y en su tercera campaña fue el segundo máximo goleador del calcio. Su calidad y olfato goleador no pasaron inadvertidos para los grandes italianos, de esa forma la Juventus le ficha en el verano de 2002, y aunque logró conquistar el Scudetto en su primera temporada, no logró reeditar sus grandes actuaciones pasadas. Con la «vecchia signora» marcó 18 goles en 55 partidos de la Serie A.

Di Vaio llegó al Valencia en el verano de 2004, tras el aterrizaje de Claudio Ranieri en su segunda etapa como entrenador che. Su primera no fue mala. Nada más comenzar la temporada, fue uno de los jugadores que marcó en la final de la Supercopa de Europa ante el Oporto. Disputó un total de 39 partidos oficiales, 27 de ellos como titular, entre Liga, Champions League y Copa de la UEFA, marcando un total de 14 goles. Sin embargo, tras la marcha de Ranieri todo cambió. Peor fue para él la llegada de Quique Flores y el fichaje de David Villa, que le relegó a la suplencia y provocó su cesión al Mónaco en enero de 2006, tras haber jugado únicamente 11 partidos y no estrenar sus registros goleadores.

Dado que ya no contaba para el Valencia, el club permitió su traspaso definitivo al club monegasco en agosto de 2006. En el verano de 2007 fichó por el Génova, y la temporada siguiente, la 2008-2009, firmó con el Bologna FC, recién ascendido a la Serie A. Esa temporada, sus goles fueron claves para evitar el descenso del club italiano, pues fue segundo máximo goleador por detrás del ex-jugador del inter Ibrahimovic. Permaneció allí cuatro buenas temporadas, en las que recuperó su instinto goleador marcando 66 goles en 143 partidos oficiales.

En 2012 fue fichado por el Montreal Impact de la MLS, donde marca 37 goles en 74 partidos disputados entre 2012 y 2014. Al finalizar esa temporada, Marco Di Vaio anunció su retirada del fútbol profesional, poniendo así un fin a una larga carrera de 20 años.